Influence of micropropagation through somatic embryogenesis on somaclonal variation in coffee (Coffea arabica): assessment of variations at the phenotypical, cytological, genetic and epigenetic level

Bobadilla Landey Roberto. 2013. Influence of micropropagation through somatic embryogenesis on somaclonal variation in coffee (Coffea arabica): assessment of variations at the phenotypical, cytological, genetic and epigenetic level. Montpellier : UM2, 186 p. Thèse de doctorat : Biologie intégrative des plantes : Université Montpellier 2

Titre français : Influence de la micro-propagation par embryogenèse somatique sur la variation somaclonale chez le caféier (Coffea arabica) : évaluation des changements au niveau phénotypique, cytologique, génétique et épigénique

Encadrement : Etienne, Hervé

Résumé : Somaclonal variation (SV) is a major concern in all micropropagation systems. It is described as the phenotypic variation displayed in in vitro-derived regenerants and it is believed to be originated from a large array of genetic and epigenetic mechanisms. Highly productive Coffea arabica hybrids are clonally disseminated in Meso-American region through somatic embryogenesis (SE). The objective of the present work in coffee is to evaluate the trueness-to-type of SE, to understand better the mechanisms involved in SV and further optimize SE conditions. We assessed the variations in the propagated plants at the phenotypic, cytogenetic (chromosome counting), genetic (mutations/AFLP, activation of transposable elements/S-SAP) and epigenetic (methylation/MSAP) level by using two complementary approaches. First, with 2 hybrids we studied industrial culture conditions expected to be weakly mutagenic thanks to the combined use of short term proliferation period (6 months) and low auxin supply (0-1.4 μM 2,4-D). Two proliferation systems i.e. secondary embryogenesis and embryogenic suspensions were compared, the latter being more productive and economic. AFLP and MSAP molecular analyses on 145 somatic seedlings showed that genetic and epigenetic polymorphisms between mother plants and emblings were extremely low, i.e. ranges of 0–0.003% and 0.07–0.18% respectively, with no significant difference between the proliferation systems. No plant was found to cumulate more than 3 methylation polymorphisms. For the two hybrids tested, massive phenotypic observations in nursery and field plots showed very low levels of SV (0.9% from 800,000 plants). Cytological analysis showed abnormal chromosome numbers (41-43, 45) in most of coffee somaclonal variants and normal numbers (44) in phenotypically normal plants. Stressful experimental conditions were also applied by using extended proliferation periods (4, 12 and 27 months) for three independent embryogenic lines established for the Caturra var. in presence of high growth regulator concentrations (4.5 μM 2,4-D, 17.8 μM 6-BA) to understand the mechanisms of culture ageing on SV. The proliferation time strongly affected the SV frequency among the 180 regenerated plants and in a highly similar way with the three embryogenic lines. No variant was found after 4 months proliferation although 30% and 94% phenotypic variants were observed in plants derived from 12 and 27 month-old cultures, respectively. Regardless the culture age and the embryogenic line, no polymorphisms were found in the 124 plants analyzed neither with AFLP nor with S-SAP using 13 different transposable elements from several families, and very limited polymorphisms were found in the methylation patterns using MSAP markers (0.049-0.087%). However, similarly to plants derived from under industrial conditions, phenotypic variants systematically showed abnormal chromosome numbers and normal plants systematically showed normal numbers. This work showed that SE based on embryogenic suspensions is reliable for true-to-type propagation of selected C. arabica varieties. It also demonstrated the importance of culture age on SV and hence the non random nature of this phenomenon. The genetic and epigenetic alterations are particularly limited during SE. The main change in most of phenotypic variants was aneuploidy showing that mitotic aberrations play a major role in SV in coffee.

Résumé (autre langue) : La variation somaclonale (VS) est une préoccupation majeure de tous les systèmes de micropropagation. Elle est décrite comme un changement phénotypique présent chez les vitroplants et pourrait être générée par une large gamme de mécanismes génétique et épigénétiques. Des hybrides de Coffea arabica hautement productifs sont distribuées sous forme clonale par embryogenèse somatique (ES) en Meso-Amérique. L'objectif de ce travail chez le caféier est d'évaluer la conformité génétique des plants multipliés par ES (somaplants), de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les SV et finalement d'optimiser les conditions de culture. Nous avons évalué les variations dans les plantes régénérées au niveau phénotypique, cytologique (comptage de chromosomes), génétique (mutations/marqueurs AFLPs, réactivation d'éléments transposables/ marqueurs S-SAP) et épigénétique (méthylation/marqueurs MSAP) en utilisant deux approches complémentaires. Tout d'abord, nous avons étudié chez deux hybrides des conditions de cultures industrielles supposées peu mutagènes grce à l'utilisation combinée d'une courte période de prolifération (6 mois) et d'un faible apporte en auxine (0-1.4 μM 2,4-D). Deux systèmes de prolifération i.e. l'embryogenèse secondaire et les suspensions embryogènes seront comparés, le dernier étant plus productif et économique. Les analyses moléculaires AFLP et MSAP sur 145 somaplants montrent que les polymorphismes génétique et épigénétique entre plantes mères et somaplants sont extrêmement réduits, i.e. dans l'intervalle 0-0,003% et 0,07-0,18% respectivement, sans différence significative entre les systèmes de prolifération. Aucun somaplant ne cumule plus de 3 polymorphismes de méthylation. Pour les deux hybrides testés, des observations phénotypiques massives en pépinière et au champ ont révélé de très faibles niveaux de VS (0,9% pour 800.000 plantes). Des analyses cytologiques ont mis en évidence des nombres de chromosomes anormaux (41-43, 45) chez la plupart des variants et des nombres normaux (44) chez les plants ayant un phénotype normal. Des conditions expérimentales a priori mutagènes ont également été appliquées en utilisant des périodes de prolifération prolongées (4, 12 et 27 mois) chez trois lignées embryogènes indépendantes de la variété Caturra en présence de concentrations élevées en régulateurs de croissance (4.5 μM 2,4-D, 17.8 μM 6-BA), afin de comprendre les mécanismes liés vieillissement des cultures interviennent sur les VS. L'étude des 180 somaplants régénérés a montré que le temps de prolifération affecte fortement la fréquence de VS et d'une manière hautement similaire pour les 3 lignées embryogènes. Aucun variant n'a été trouvé après 4 mois de prolifération alors que 30% et 94% de variants phénotypiques ont été caractérisés chez les plants issus de cultures de 12 et 27 mois, respectivement. Quels que soient l'ge de culture et la lignée embryogène, aucun polymorphisme n'a été trouvé chez les 124 somaplants analysés que ce soit avec les marqueurs AFLP, ou même S-SAP en étudiant 13 éléments transposables appartenant à plusieurs familles, et des polymorphismes très faibles ont été trouvés dans les profils de méthylation avec les MSAP (0,049-0,087%). Cependant, de façon similaire aux somaplants produits en conditions industrielles, les variants phénotypiques montrent systématiquement des nombres de chromosomes anormaux (41-43) et les plants normaux le nombre de chromosomes attendu. Ce travail montre que l'ES s'appuyant sur des suspensions embryogènes peut garantir une propagation conforme des variétés sélectionnées de C. arabica. Il démontre également l'importance de l'ge des cultures sur l'apparition de VS et donc le caractère non aléatoire du phénomène. Les changements génétiques et épigénétiques sont particulièrement limités durant l'ES. Le principal changement chez la plupart des variants est l'aneuploidie, ce qui montre que les aberrations mitotiques jouent un rôle majeur dans les VS chez le caféier.

Mots-clés Agrovoc : Coffea arabica, micropropagation, embryon somatique, variation phénotypique, marqueur génétique, épigénétique, multiplication végétative, régénération in vitro, recherche interdisciplinaire, cytologie, agronomie, biologie moléculaire, amélioration des plantes, contrôle continu, variation somaclonale, clone

Mots-clés géographiques Agrovoc : Amérique centrale, Nicaragua, Brésil, Colombie, Guatemala, Mexique

Mots-clés complémentaires : Épigénétique

Classification Agris : F30 - Génétique et amélioration des plantes
F02 - Multiplication végétative des plantes
U30 - Méthodes de recherche

Champ stratégique Cirad : Axe 1 (2005-2013) - Intensification écologique

Auteurs et affiliations

• Bobadilla Landey Roberto, CIRAD-BIOS-UMR IPME (FRA)

Source : Cirad-Agritrop (https://agritrop.cirad.fr/577598/)

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