Characterization of a candidate gene for drought tolerance in Coffea: the CcDREB1D gene, in contrasting genotypes of Coffea canephora and related species

Costa Alves Gabriel. 2015. Characterization of a candidate gene for drought tolerance in Coffea: the CcDREB1D gene, in contrasting genotypes of Coffea canephora and related species. Montpellier : Montpellier SupAgro, 190 p. Thèse de doctorat : Biologie intégrative : Montpellier SupAgro Centre international d'études supérieures en sciences agronomiques

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Titre français : Caractérisation d'un gène candidat pour la résistance à la sécheresse chez Coffea : le gène CcDREB1D dans des génotypes contrastés de Coffea canephora et d'espèces apparentées

Encadrement : Marracini, Pierre ; This, Dominique

Résumé : Coffee is the world's second most valuable traded commodity after crude oil. Like for other crops, drought is the key factor affecting plant development, flowering, productivity, fruits development and their quality. In such a context, the generation of drought-tolerant coffee varieties has now turned into one of the priorities of many research institutes. In coffee, several candidate genes for drought tolerance have been identified. This was the case of CcDR EB1D that showed increased gene expression upon drought stress mainly in leaves of Coffea canephora drought-tolerant clones. In several plant species, the DREBs genes play a key role in plant responses to abiotic stress. Based on these information, an in depth characterization of CcDREB1D was initiated by (i) studying the genetic diversity present in DREB1D loci, (ii) identifying DREB coffee subfamily members and evaluating phylogenetic relations between CcDREB1D and homologs from other plant species, and ( iii) performing a functional characterization of CcDREB1D promoters by homologous genetic transformation of C. arabica. Sequence variability in DREB1D promoter and coding regions was evaluated using 38 Coffea accessions most of them characterized by different phenotypes (tolerance vs. susceptibility) regarding to drought. Our findings show several evidences of association between drought tolerance and the genetic variations on DREB1D promoter region. Further analyses indicated that these promoters are evolving by the rearrangement of cis-regulatory elements, and could influence DREB1D expression. The recent release of the C. canephora genome sequence allowed us to identify the DREB gene family in this species composed of at least 31 canonical DREB genes. Compared to other plants, no specific amplification of the DREB gene family was observed. A reconciled phylogenetic tree constructed with homologs from other species allowed us to identify the coffee members of the DREB subgroups I, II, III and IV, in reference to their classification previously established in Arabidopsis. In addition, CcDREB1D is the nearest C. canephora orthologue of AtDREB1/CBF group, but any functional inference could not be done due to a recent duplication that lead to DREB1/CBF group sub functionalization in Arabidopsis. These results reinforced the necessity of CcDREB1D functional characterization in coffee. The study of genetic variability revealed a major source of nucleic diversity in the promoter region of DREB1D genes from C. canephora, with potential implication in local adaptation to drought tolerance. This is for example the case for the promoters of drought-tolerant clone 14 and drought-sensitive clone 22 of C. canephora known to present different CcDREB1D expression profiles regarding drought. In order to perform the functional analysis of these promoters, full length and truncated version of allelic and homolog forms of CcDREB1D promoters were fused to the GUS reporter gene. Transgenic plants of C. arabica harboring these constructions were regenerated. The spatiotemporal, tissue, cell and allelic-specific regulation of CcDREB1D promoters was analyzed by detecting GUS enzymatic activity. During drought stress, the full-length CcDREB1D promoter drives leaf-specific GUS activity only in epidermic, parenchyma and guard-cells. By comparing the different constructs, the most upstream 700 bp of allelic and homolog CcDREB1D promoters were shown to be necessary for the leaf-specific expression. In addition, allelic-specific expression observed in response to different (PEG and relative humidity) treatments mimicking drought stress showed that nucleic variations present between CcDREB1D promoter allelic forms affect the spatiotemporal regulation of the GUS reporter gene.

Résumé (autre langue) : Après le pétrole, le café est la seconde matière première cotée sur les marchés financiers. Comme pour d'autres grandes cultures, la sécheresse affecte à la fois le développement de la plante, la floraison, la productivité, le développement de fruits et leur qualité. Dans ce contexte, la création de variétés de caféiers tolérantes à la sécheresse est l'une des priorités des instituts de recherche. Chez le caféier, plusieurs gènes candidats pour la tolérance à la sécheresse ont été identifiés. C'est le cas de CcDREB1D dont l'expression augmente à la sécheresse dans les feuilles des clones de Coffea canephora résistants. Les gènes DREBs jouent un rôle clé dans les réponses aux stress abiotiques des végétaux. Sur la base de ces informations, une analyse approfondie de CcDREB1D a été initiée (i) par l'étude de la diversité génétique de ce gène, (ii) en identifiant les membres des sous - familles DREB de caféier et en évaluant des relations phylogénétiques entre CcDREB1D et ses homologues chez d'autres espèces et (iii) en menant une caractérisation fonctionnelle des promoteurs CcDREB1D par transform ation génétique chez C. arabica. La variabilité des promoteurs et des régions codantes DREB1D a été évaluée chez 38 accessions de Coffea, la plupart caractérisées par différents phénotypes vis - à - vis de la sécheresse. Nos résultats montrent qu'il existe des associations entre la tolérance à la sécheresse et les variations génétiques des promoteurs DREB1D. D'autres analyses ont montré que ces promoteurs ont évolué par réarrangements d'éléments cis - régulateurs qui pourraient influencer l'expression des gènes DREB1D. La récente publication de la séquence du génome de C. canephora, nous a permis d'identifier la famille de gènes DREB de cette espèce composée d'au moins 31 gènes de type DREB . Par comparaison aux autres espèces, aucune amplification spécifique de la famille des gènes DREB n'est observée. Un arbre phylogénétique construit avec les gènes homologues d'autres espèces a permis d'identifier les gènes de caféier des sous - groupes DREB I, II, III et IV, en référence à leur classification préétablie chez Arabidopsis. De plus, CcDREB1D est l'orthologue de C. canephora le plus proche du groupe AtDREB1/CBF mais, en raison d'une duplication récente menant à une sous - fonctionnalisation du groupe DREB1/CBF d' Arabidopsis , aucune inférence de fonction par homologie n'est possible. Ces résultats renforcent la nécessité de mener une caractérisation fonctionnelle des gènes CcDREB1D de caféier. L'étude de la variabilité génétique a révélé une forte diversité nucléique dans les promoteurs des gènes DREB1D de C. canephora. C'est par exemple le cas pour les promoteurs des clones 14 (tolérant à la sécheresse) et 22 (sensible à la sécheresse) de C. canephora connus pour présenter des profils d'expression différentiels du gène CcDREB1D vis - à - vis de la sécheresse. Afin de réaliser l'analyse fonctionnelle de ces promoteurs, les séquences entières ou tronquées des formes alléliques et homologues des promoteurs CcDREB1D ont été fusionnées avec le gène rapporteur GUS. Les plantes transgéniques de C. arabica contenant ces constructions ont été régénérées. La régulation spatio - temporelle, tissulaire, cellulaire et allèle - spécifique des promoteurs CcDREB1D a été analysée par détection de l'activité enzymatique GUS. En conditions normales (sans stress), aucune activité GUS n'a été observée démontrant le caractère stress dépendant de l'activité de ces promoteurs. En condition de sécheresse, la version pleine longueur du promoteur CcDREB1D permet une activité GUS spécifiquement dans les feuilles et seulement dans l'épiderme, le parenchyme et les cellules de garde. En comparant les différentes constructions, les 700 paires de base les plus en amont des allèles et homologues des promoteurs CcDREB1D se révèlent essentielles pour l'expression feuille - spécifique. Par ailleurs, l'expression allèle-spécifique observée en réponse aux différents traitements (PEG et humidité relative) imitant la sécheresse, montre que les variations nucléiques des formes alléliques CcDREB1D affectent la régulation spatio-temporelle du gène rapporteur GUS.

Mots-clés Agrovoc : Coffea, Coffea canephora, résistance à la sécheresse, résistance génétique, gène, stress dû à la sécheresse, variation génétique, transformation génétique, plante transgénique, phylogénie, génotype, séquence nucléotidique, Coffea arabica, Coffea eugenioides, Arabidopsis thaliana, génie génétique, stress abiotique