Validation d'un diagnostic de la peste porcine africaine (PPA) utilisant des papiers buvards et caractérisation moléculaire de souches malgaches

Randriamparany Tantely. 2016. Validation d'un diagnostic de la peste porcine africaine (PPA) utilisant des papiers buvards et caractérisation moléculaire de souches malgaches. Antananarivo : Université d'Antananarivo, 169 p. Thèse de doctorat : Biotechnologie, Microbiologie : Université d'Antananarivo

Titre anglais : African Swine Fever diagnosis adapted to tropical conditions by the use of dried-blood filter papers and molecular characterization of Malagasy strains

Encadrement : Raherimandimby, Marson ; Albina, Emmanuel

Résumé : Au cours de cette étude, la performance du papier buvard Whatman 3MM pour collecter, stocker du sang séché à température ambiante, de détecter le virus et l'anticorps de la PPA a été effectuée. Des échantillons des études expérimentales fournis par les laboratoires de recherche en Europe, de prélèvement des abattoirs et des élevages de Madagascar et de Côte d'Ivoire ont été utilisés pour évaluer l'aptitude de ce papier buvard sur les techniques PCR conventionnelles et à temps réel (Taqman et UPL), l'isolement viral et la détection des anticorps par ELISA. Le papier filtre 3MM a été utilisé directement sans extraction d'acide nucléique pour la détection du virus en utilisant les techniques conçues pour les prélèvements standards (sang, organe, sérum). Utilisant le papier buvard 3MM, il est possible de détecter la maladie très précocement de 1 à 3 jours après l'infection. Les résultats sérologiques et virologiques ont montré des spécificités de 100% pour toutes les analyses. Par contre, les sensibilités sont plus variables (65,2 – 95,7%) selon les techniques utilisées lors des comparaisons entre papier buvard Whatman 3MM et les échantillons standards. En plus, une comparaison de la détection des anticorps entre papier buvard 3MM / sérum donne une séroprévalence semblable respectivement de 32,6% [IC 95 : 23,2% à 42%] et 34,8% [IC 95 : 25,3% à 44,3%]. A Madagascar, la détermination de la circulation du virus PPA montre une séroprévalence très faible de 0,17%. Par contre la prévalence virologique est de 17,8% [IC95 : 10,26% à 25,66%]. La caractérisation moléculaire des souches fait comprendre l'épidémiologie de la maladie. A Madagascar, cette maladie a été ignorée avant et a été vraisemblablement introduite mi-1997 dans la région de Taolagnaro par une souche mozambicaine. Les analyses phylogénétiques des souches malgaches ont portées sur les gènes B646L, KP177R et CP204L utilisant la méthode du maximum de vraisemblance. Les résultats de cette caractérisation moléculaire ont montré l'existence des souches malgaches appartenant dans un même cluster du génotype II. Les comparaisons des gènes B646L avec les souches anciennes de Madagascar montrent une ressemblance à 100% suggérant qu'elles proviennent d'un même isolat. Le papier buvard Whatman 3MM présente plusieurs avantages. Il est un support peu couteux, simple et rapide pour la collecte de sang, la préservation à température ambiante et le diagnostic de la maladie de la PPA en utilisant l'ELISA, les PCR directes conventionnelles et à temps réel, et l'isolement du virus. D'autres avantages du papier filtre 3MM comprennent le plus petit volume de sang requis et la capacité de recueillir un grand nombre d'échantillons (Dubay et al, 2006).

Résumé (autre langue) : African swine fever (ASF) is a highly contagious virus infection of wild and domestic pigs. It is caused by a DNA virus, Asfivirus, currently the sole arbovirus member of the Asfarviridae family, but can also be acquired through the ingestion of contaminated feedstuffs an d transmitted by certain tick species. It was first described in Kenya in 1921 and since then many countries worldwide were infected and produced a serious socioeconomic impact. No vaccines or drugs are available to prevent or treat ASF infection. Therefore, it is particularly important that ASF-free areas be maintained free by preventing the introduction of the disease. All control and eradication measures applicable are based on classical disease control methods, including intensive surveillance, epidemiological investigation, tracing and stamping out of infected herds. These measures are combined with strict quarantine and biosecurity measures and animal movement control. These informations illustrated the importance of the fast diagnosis for control and eradication plan. During this study, blood, sera, and corresponding dried blood filter paper samples from experimentally infected pigs from three European Laboratories (CISA and CRe SA, Spain and ANSES, France) and from farms and abattoirs in Madagascar and pig farm samples from Côte d'Ivoire were collected and analyzed Conventional and real-time PCR, viral isolation and antibody detection by ELISA were performed on paired samples (blood/tissue versus dried-blood 3MM filter papers) were used directly in the conventional and rea-time PCR without previous extraction of nucleic acids. It was possible to use Whatman 3MM filter papers collected as early as 1–3 days after infection in direct conventional or real-time PCRs for early detection of ASFV genome. All tests on 3MM filter papers had 100% specificity but sensitivity had more variable (65.2 – 95.7%) compared to the gold standards. In addition, blood-dried filter papers were tested in ELISA for antibody detection and the observed sensitivity was very close to conventional detection on serum samples and gave comparable results respectively of 32.6% [95% CI, 23. 2 - 42] et 34.8% [95% CI, 25.3 - 44.3]. In this study, ASFV continued to be detected for at least 9 monthsat ambient temperature (22–25°C), and it is likely that even higher temperatures will not interfere with the preservation of the material; then serological and virological test gave respectively 0.17% and 17 .8% [95% CI, 10.26 - 25.66], sero-and viro-prevalence. ASF is still endemic to Madagascar since its introduction in 1997. Molecular characterization of isolates has demonstrated which may offer useful epidemiological information of the disease. Isolate genotyping was assessed by comparing concatenated amino acid sequences of proteins encoded B646L, KP177R and CP204L sequences using a maximum likelihood algorithm. The studied Malagasy previous viruses displayed 100% p72 gene sequence identity into one cluster of genotype II that suggested there origin from one isolate until now. In summary, Whatman 3-MM filter papers are a cheap, simple and rapid support for blood collection, preservation and ASF disease diagnosis either by ELISA, direct conventional and real-time PCRs, and virus isolation. Other advantages of 3MM filter paper strips include the smaller volume of blood that is required and the ability to collect a large number of samples (Du bay et al., 2006). In this study, What man 3-MM filter papers proved to be a suitable support for the collection, storage and use of blood in remote areas of tropic al countries without the need for a cold chain.

Mots-clés Agrovoc : peste porcine africaine, virus peste porcine africaine, test biologique, Test ELISA, PCR, diagnostic, sérologie, phylogénie, biologie moléculaire, épidémiologie

Mots-clés géographiques Agrovoc : Madagascar, Côte d'Ivoire, Europe

Mots-clés libres : Peste porcine africaine, Diagnostic, Madagascar

Classification Agris : L73 - Maladies des animaux
U30 - Méthodes de recherche

Champ stratégique Cirad : Axe 4 (2014-2018) - Santé des animaux et des plantes

Auteurs et affiliations

• Randriamparany Tantely, Université d'Antananarivo (MDG)

Source : Cirad-Agritrop (https://agritrop.cirad.fr/581387/)

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