Genetic structure of diploid gametes for the production of triploid citrus hybrids

Rouiss Houssem. 2017. Genetic structure of diploid gametes for the production of triploid citrus hybrids. Valencia : Universitat Politecnica de Valencia, 148 p. Thesis Ph. D. : Universitat Politecnica de Valencia

Thèse

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Encadrement : Navarro Lucas, Luis ; Ollitrault, Patrick ; Aleza, Pablo

Résumé : The citrus industry is an important source of incomes for both individual growers and producing countries. Therefore, breeding for quality especially seedlessness has a pivotal role for the market, since consumers demand seedless fruits. Recovery of triploid hybrids through ploidy manipulation is a very valuable methodology to recover seedless citrus varieties. Citrus triploid hybrids can be recovered through 2x x 2x taking advantage of the unreduced (2n) gametes formation. 2x x 4x and 4x x 2x sexual hybridizations are also widely exploited. Underlying the production mechanisms and genetic structures of diploid gametes is a key for optimizing polyploid breeding strategies. Two main mechanisms have been found in angiosperm for production of unreduced gametes: First Division Restitution (FDR) and Second Division Restitution (SDR). On the other hand, although tetraploid rootstocks display promising agronomic traits, their meiotic behavior and their segregation analysis is still mostly unknown in citrus. Disomic and tetrasomic models were defined as extreme models for tetraploid segregation, however, an intermediate inheritance model has been described for several crops. In this framework, this thesis aimed to study three main aspects: (i) the mechanisms underlying unreduced pollen gamete formation in the diploid 'CSO' tangor hybrid used as male parent in 4x x 2x triploid breeding programs, (ii) the frequencies and mechanism s involved in the unreduced 2n female gametes production for 'Eureka Frost' and 'Fino' lemon genotypes, and (iii) the interspecific recombination and the resulting diploid gamete structures of doubled-diploid 'Mexican' lime to evaluate the possibility that natural interploid hybridization maybe the origin of C. latifolia ('Tahiti' lime type) and C. aurantifolia ('Tanepao' lime type) triploid varieties. The production of 54 tetraploid hybrids from 4x x 2x sexual hybridizations allowed the analysis of the mechanisms underlying unreduced pollen gamete formation. SSR and SNP molecular markers revealed that the majority of these plants were obtained from unreduced 2n pollen of the diploid tangor parent. Then, the maximum-likelihood method based on parental heterozygosity restitution (PHR) of centromeric loci revealed that both FDR with predominant occurrence and to a lower extend SDR were the mechanisms leading to unreduced male gamete formation in the tangor studied. These observations were confirmed by the analysis of PHR pattern along the linkage group (LG) 2. To our knowledge, this is the first report of tetraploid citrus progenies arising from unreduced pollen and the first description of the coexistence of two meiotic restitution mechanisms (SDR and FDR) producing unreduced pollen in citrus. In order to study the frequencies and the mechanisms involved in the unreduced 2n female gametes production in two different genotypes of lemon, we produced 43 triploid and tetraploid hybrids from 2x x 2x and 2x x 4x sexual hybridizations using 'Eureka Frost' and 'Fino' as female parents. The frequencies of 2n gamete production were respectively 4.9% and 8.3%. The maximum-likelihood analysis and pattern of PHR along LG1 revealed that SDR is the main mechanism of unreduced female lemon gametes (88%), followed by FDR or pre-meiotic doubling (PRD) (7%) and post-meiotic genome doubling (PMD) mechanisms (5%). This is the first report of the production of a large number of lemon progenies from 2n gametes and the first identification of a new mechanism, PMD that has never been observed in citrus and has rarely been described in other herbaceous or woody species. Across both studies, we demonstrated at the methodological level the effectiveness of using two complementary approaches, the analysis of the PHR pattern in one LG and the maximum-likelihood method based on centromeric loci for distinguishing between the different mechanisms of unreduced gamete production. We analyzed the meiotic mechanisms of a doubled diploid 'Mexican' lime, the interspecific recombination and the resulting diploid gamete structures combining a segregation analysis of SSR and SNPs markers, a cytogenetic study and pollen viability evaluation. We concluded that the doubled-diploid 'Mexican' lime had a predominantly disomic segregation for three LGs, intermediate inheritance with disomic tendency was found for five LGs and intermediate models for one LG. The resulting interspecific diploid gamete structures displayed high C. medica / C. micrantha heterozygosity. The revealed genetic structures of the diploid gametes produced by the doubled–diploid 'Mexican' lime are compatible with the hypothesis that 'Tahiti' and 'Tanepao' triploid varieties results from interploid hybridization involving a doubled-diploid 'Mexican' like lime. This disomic tendency limits the recombination and the diversity of the diploid gamete population; however the observed pollen viability restoration at tetraploid level could be advantageous for intensive breeding projects. The implications for triploid breeding projects of the meiotic behavior leading to unreduced pollen in 'CSO' tangor, unreduced ovules in lemons and diploid gametes of the DD 'Mexican' lime are discussed.

Résumé (autre langue) : La citricultura es una fuente importante de ingresos tanto para los citricultores como para los países productores. La mejora de la calidad e especialmente la ausencia de semillas en los frutos, es una exigencia del mercado de consumo en fresco ya que los consumidores no aceptan la presencia de semillas en los frutos. La obtención de híbridos triploides mediante la manipulación del nivel de ploidía es una metodología eficaz para la obtención de nuevas variedades de cítricos sin semillas. En cítricos se pueden obtener híbridos triploides mediante cruzamientos 2x x 2x como consecuencia de la formación de gametos no reducidos (2n) y mediante hibridaciones sexuales entre parentales diploides y tetraploides ( 2x x 4x y 4x x 2x ). La identificación de los mecanismos implicados en la formación de gametos no reducidos y las estructuras genéticas de los gametos diploides originados por los parentales tetraploides es crucial para optimizar las estrategias de mejora a nivel poliploide. En angiospermas se han descrito principalmente dos mecanismos de formación de gametos no reducidos, Restitución de la Primera División meiótica (FDR) y Restitución de la Segunda División meiótica (SDR). Por otro lado, se ha observado que los portainjertos tetraploides de cítricos presentan un comportamiento agronómico muy intere sante, pero existe un gran desconocimiento sobre las meiosis y modelos de segregación de este tipo de plantas. Los modelos disómico y tetrasómico son modelos extremos para la segregación de genotipos tetraploides, aunque se han descrito modelos de segregación intermedios para diferentes cultivos. En este contexto, esta tesis doctoral estudia tres aspectos principales: (i) los mecanismos responsables de la formación de gametos no reducidos de polen originados por un híbrido diploide entre clementina y naran jo (tangor `CSO) que se ha utilizado como parental masculino en hibridaciones sexuales 4x x 2x , (ii) las frecuencias y los mecanismos implicados en la producción de gametos no reducidos femeninos en dos genotipos de limón, `Eureka Frost y`Fino, y (iii) el análisis de la recombinación interespecífica y las estructuras de los gametos diploides originados por la lima `Mejicana ́ doble diploide con el objetivo de evaluar la posibilidad de que las variedades triploides de lima C. latifolia (lima tipo `Tahiti ́ ) y C. aurantifolia (lima tipo Tanepao) se hayan originado a partir de un cruzamiento natural a nivel interploide. La obtención de 54 híbridos tetraploides a partir de hibridaciones sexuales 4x x 2x permitió analizar los mecanismos responsables de la formación de gametos no reducidos de polen. El análisis de estas plantas con marcadores moleculares SSRs y SNPs reveló que la mayoría de estas plantas se obtuvieron a partir de gametos no reducido de polen del parental masculino diploide tangor `CSO ́. A continuación, el análisis mediante la utilización del método de máxima verosimilitud basado en la restitución de la heterocigosidad parental (PHR) en los loci centroméricos indicó que FDR y SDR son los mecanismos implicados con una mayor dominancia de FDR res pecto SDR. Estos resultados se confirmaron posteriormente mediante el análisis de la restitución de la heterocigosidad en el grupo de ligamiento (LG) 2. Con los datos publicados hasta la fecha, es la primera vez que se han obtenido progenies tetraploides de cítricos mediante gametos no reducidos de polen y es la primera descripción en cítricos de la coexistencia de dos mecanismos de restitución meiótica, SDR y FDR, implicados en la formación de gametos 2n de polen. Con el fin de estudiar las frecuencias y los mecanismos implicados en la producción de gametos no reducidos en dos genotipos diferentes de limón, se obtuvieron 43 híbridos triploides y tetraploides a partir de hibridaciones sexuales 2x x 2x y 2x x 4x utilizando los limones diploides `Eureka Frost ́ y `Fino ́ como parentales femeninos. Las frecuencias de producción de gametos 2n fueron respectivamente 4,9% y 8,3%. El análisis de máxima verosimilitud y el patrón de PHR a lo largo del LG1 reveló que SDR es el mecanismo principal implicado en la formación de gametos no reducidos femeninos (88%), seguido por FDR o duplicación del genoma pre-meiosis (PRD) (7%) y se identificó un nuevo mecanismo originado a partir de la duplicación del genoma post-meiosis (PMD) (5%). En este trabajo se describe por primera vez en cítricos la producción de un elevado número de híbridos de limón a partir de gametos 2n y es la primera vez que se identifica un nuevo mecanismo PMD que nunca se ha observado en cítricos y rara vez se ha descrito en otras especies herbáceas o leños as. En ambos estudios se demostró a nivel metodológico la efectividad del uso de dos métodos complementarios, el análisis del patrón de PHR a lo largo de un LG y el método de máxima verosimilitud basado en la utilización de loci centroméricos para distinguir entre los diferentes mecanismos implicados en la formación de gametos no reducidos en limón. También se ha analizado el modelo de segregación cromosómica de la lima `Mejicana ́ doble diploide así como la recombinación interespecífica y las estructuras de los gametos diploides resultantes. Este trabajo se ha realizado mediante el análisis de la viabilidad del polen junto con un análisis citogenético y con marcadores SSRs y SNPs. Estos trabajos nos han permitido concluir que la lima `Mejicana ́ DD presenta una segregación predominantemente disómica para tres LGs, herencia intermedia con tendencia disómica para cinco LGs y un tipo de segregación intermedia para un LG. Las estructuras de los gametos diploides interespecíficos resultantes mostraron una alta het erocigosis en C. medica/C. micrantha, parentales de la lima `Mejicana ́. Las estructuras genéticas observadas en los gametos diploides de la lima `Mejicana ́ doble diploide son compatibles con la hipótesis de que las variedades triploides de lima `Tahiti ́ y `Tanepao ́ se obtuvieran a partir de una hibridación interploide en la cual uno de los parentales fuese la lima `Mejicana ́ doble diploide. El tipo de segregación disómico conlleva una limitación de la recombinación y la diversidad genética de la población de gametos diploides. Sin embargo la viabilidad del polen de la lima `Mejicana ́ DD en comparación con la lima `Mejicana ́ diploide permite la utilización de este genotipo como parental para la obtención de nuevas variedades de lima en programas de mejora genética. Finalmente, se discuten las implicaciones en los programas de mejora genética para la obtención de híbridos triploides el comportamiento meiótico que origina la formación de gametos no reducidos de polen en el tangor `CSO ́, la formación de gameto s no reducidos de óvulo en los limones y los gametos diploides producidos por la lima `Mejicana ́ doble diploide.

Mots-clés Agrovoc : Citrus, amélioration des plantes, génétique des populations, triploïdie, tétraploïdie, gamétogénèse, hybridation, hybride, recombinaison, hybridation interspécifique, polyploïdie, méiose, polymorphisme génétique, pollen, gamète, physiologie de la reproduction, marqueur génétique, Citrus limon, Citrus macrophylla, Citrus medica, Citrus aurantiifolia