Xanthomonas albilineans, l'agent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre : caractérisation et variabilité des bases génétiques du pouvoir pathogène, en Guadeloupe et dans le monde

Champoiseau Patrice. 2006. Xanthomonas albilineans, l'agent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre : caractérisation et variabilité des bases génétiques du pouvoir pathogène, en Guadeloupe et dans le monde. Pointe-à-Pitre : UAG, 187 p. Thèse de doctorat : Science de la vie. Phytopathologie : Université des Antilles et de la Guyane

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Encadrement : Rott, Philippe

Résumé : Xanthomonas albilineans is the causal agent of sugarcane leaf scald, a disease that occurs in at least 60 geographical locations in the world . Impact of the disease can be very severe (yield lasses, plant death) when susceptible sugarcane varieties are infected by the pathogen. During the last two decades, outbreaks of the disease have been reported in several geographical areas, including Guadeloupe. Control of the disease and of the pathogen evolution can be achieved through breeding and screening of resistant sugarcane varieties. However, to insure long-term control of the disease, it is essential to determine the variability of X. albilineans and, in particular, the variations in the mechanisms of pathogenicity. Three main factors involved in pathogenicity of X. albilineans have been identified: i) production of a toxin called albicidin, ii) symptom expression on leaves and iii) colonization of the sugarcane stalk. Albicidin plays a key role in symptom incitation by the pathogen. According to several authors, the toxin may also facilitate sugarcane stalk colonization. First studies of the genetic base of albicidin production by strain Xa23R1, from Florida, lead to the identification of three regions of the pathogen's genome. These regions include 22 ORFs (albi to albXX) involved or potentially involved in biosynthesis of the toxin. So far, no hrp or avr genes that were identified in most other phytopathogenic bacteria have been found in X. albilineans. Therefore, ether genes that play a key role in pathogenicity of this pathogen remain to be identified. ln the first part of this thesis, we looked for a relationship between variability of genes involved or potentially involved in albicidin biosynthesis and variability of the factors known to be involved in pathogenicity of X. albilineans. Ten haplotypes and 2 major genetic groups, called ALB-RFLP (exposant)571-A and ALB-RFLP (exposant)571 -B, were identified among 137 strains of X. albilineans from 27 geographical areas. Almost all strains of the pathogen that were isolated during the last 15 years in geographical areas where leaf scald outbreaks were reported belonged to group ALB-RFLP(exposant)571-B. Additionally, a strong relationship was found between these 2 genetic groups and the AFLP and RFLP groups that were previously described for this pathogen. Variability in albicidin produced in vitro by X. albilineans was shawn and albivars were identified among the 1 39 bacterial strains used in this study. However, no relationship between this variability and genetic groups ALB-RFLP(exposant)571 -A and ALB-RFLP(exposant)571 -B was found. Different pathogenicity groups, based on symptom severity (pathotypes) and pathogen population density in the stalk (colovars), were identified among 21 strains of X. albilineans which represented different albivars and genetic groups identified in this study. No relationship between these pathogenicity groups and the ALB-RFLP (exposant)571-A and ALB-RFLP(exposant)571-B groups was found. Nevertheless, these results suggested that sugarcane stalk colonization by X. albilineans involves ether factors than albicidin, and the research of these factors is described in the second part of this thesis. In the second part of this thesis, we aimed to identify and to characterize the variability of new genes involved in pathogenicity of X. albilineans. Two techniques were used with 1 9 strains of the pathogen from Guadeloupe, representing different pathotypes (based on intensity of sugarcane stalk colonization and severity of disease symptoms), but that were genetically identical (based on RFLP data of the albicidin biosynthesis genes or the whole bacterial genome): i) AF LP analysis of the whole genome with 16 selective primer combinations. Variability among strains and 2 major genetic groups were identified, but no relationship between this genetic variability and variability in pathogenlcity of X. albilineans was found. ii) PCR amplification of genes involved in pathogenicity of ether bacterial plant pathogens closely related to X. albilineans, and particularly X. campestris pv. campestris and Xylella fastidiosa. Forty primer combinations representing 40 genes were used, but only three genes (pilB, rpfA et xpsE) could be amplified from X. albilineans. No difference in the nucleotide sequence of these genes in 9 strains of X. albilineans differing in pathogenicity was found. Phylogenetic study based on sequences of these three genes and two housekeeping genes revealed that X. albilineans represents a distinct group between the X. campestris group and Xylella fastidiosa, another xyleminvading bacterium. Sequencing of the whole genome of strain GPEPC73, isolated du ring this thesis, is in progress at Genoscope in Evry/France. Obtaining and deciphering the who le sequence of the genome of X. albilineans is the next step for the comprehension of the genetic basis of X. albilineans pathogenicity, and for better management of sugarcane resistance against leaf scald disease in Guadeloupe, and in the world.

Résumé (autre langue) : Xanthomonas albilineans est l'agent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre, une maladie pré-sente dans plus de 60 zones géographiques à travers le monde. Cette maladie peut avoir un impact très important (perte de rendement, mortalité des plantes) lorsque des variétés de canne à sucre sensibles sont cultivées. Des recrudescences de la maladie ont été observées au cours des deux dernières décennies dans plusieurs zones géographiques, et notamment en Guadeloupe. La sélection variétale représente le moyen de lutte le plus efficace contre I'échaudure des feuilles et l'évolution de son agent causal. Cependant, pour assurer une gestion et un contrôle durable de la maladie, il est nécessaire de connaître la variabilité de X. albilineans, et plus précisément les mécanismes impliqués dans la variabilité de son pouvoir pathogène. Trois composantes du pouvoir pathogène ont été identifiées chez X. albilineans: i) la production d'une toxine, I'albicidine, ii) la capacité à induire des symptômes foliaires et iii) la capacité de colonisation de la tige de canne à sucre. L'albicidine joue un rôle clé dans l'induction des symptômes foliaires de la maladie. Selon certains auteurs, elle pourrait également jouer un rôle dans la colonisation de la tige de canne à sucre. L'étude des bases génétiques de I'albicidine chez la souche Xa23R1, originaire de Floride, a permis d'identifier trois régions du génome regroupant 22 ORFs (albl à aIbXXII) potentiellement impliqués dans la production de la toxine. Par ailleurs, contrairement à la plupart des bactéries phytopathogènes, aucun gène hrp ou avr n'a été mis en évidence chez X. albilineans et d'autres gènes jouant un rôle dé dans la pathogénie de cette bactérie restent à identifier. Dans la première partie de cette thèse, nous avons analysé les relations entre la variabilité des gènes putatifs impliqués dans la biosynthèse de I'albicidine et la variabilité des différentes composantes du pouvoir pathogène de X. albilineans. Dix haplotypes distincts et 2 groupes génétiques majeurs, nommés ALB-RFLP (exposant)571-A et ALB-RFLP(exposant)571-B, ont été identifiés à partir de 137 souches de X. albilineans originaires de 27 zones géographiques. Presque toutes les souches de X. albilineans originaires de zones géographiques où une recrudescence de l'échaudure des feuilles a eu lieu ces quinze dernières années appartiennent au groupe ALB-RFLP(exposant)571-B. De plus, il existe une très forte correspondance entre ces deux groupes génétiques et les groupes AFLP et RFLP déjà décrits par ailleurs pour cet agent pathogène. Des variants de production d'albicidine in vitro (albivars) ont aussi été identifiés parmi les 139 souches de X. albilineans testées, mais aucune relation entre cette variabilité et les groupes génétiques ALB-RFLP(exposant)571-A et ALB-RFLP(exposant)571-B n'a pu être mise en évidence. Par ailleurs, des groupes de pathogénie ont été identifiés, sur la base de l'intensité des symptômes foliaires (pathotypes) et de l'intensité de colonisation de la tige (colovars), chez 21 souches de X. albilineans produisant des quantités d'albicidine différentes et qui sont représentatives de la variabilité génétique révélée au cours de cette étude. Aucune relation n'a pu être mise en évidence entre ces groupes de pathogénie et les groupes génétiques ALB-RFLP(exposant)571-A et ALB-RFLP(exposant)571-B. Néanmoins, l'ensemble de ces résultats suggère que la capacité de colonisation de la tige de canne à sucre implique d'autres facteurs que I'albicidine, et leur étude a fait l'objet des recherches décrites dans la deuxième partie de cette thèse. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons essayé d'identifier et de caractériser la variabilité de nouveaux gènes impliqués dans la pathogénie de X. albilineans. Deux approches ont été utilisées avec 19 souches de l'agent pathogène originaires de Guadeloupe, de pathogénie différente (capacité différente à coloniser la tige de canne à sucre et à induire des symptômes de la maladie) et pour lesquelles aucune variabilité n'a été détectée par RFLP au niveau des gènes de biosynthèse de l'albicidine et sur l'ensemble du génome de la bactérie : i) Analyse AFLP du génome de la bactérie en utilisant 16 combinaisons d'amorces sélectives. Une variabilité entre souches et deux groupes génétiques majeurs ont été identifiés, mais aucune relation entre cette variabilité génétique et la variabilité du pouvoir pathogène de X. albilineans n'a pu être montrée. ii) Amplification par PCR de gènes impliqués dans la pathogénie d'espèces bactériennes proches de X. albilineans, et notamment X. campestris pv. campestris et Xylella fastidiosa. Quarante couples d'amorces représentant 40 gènes ont été testés mais seulement trois gènes (pi/B, rpfA et xpsE) ont pu être amplifiés chez X. albilineans. Aucune différence n'a été observée dans la séquence nucléotidique de ces gènes chez 9 souches de X. a/bilineans à pathogénie variable. Une étude phylogénétique réalisée à l'aide des séquences de ces trois gènes et de deux gènes de ménage a permis de montrer que X. albilineans représente un groupe distinct situé entre le groupe X. campestris et Xylel/a fastidiosa, une autre bactérie phytopathogène du xylème. Le génome complet de la souche GPEPC73, isolée au cours de cette thèse, est actuellement séquencé au Genoscope, à Evry. L'obtention et le déchiffrage de la séquence complète du génome de X. albilineans constituent la prochaine étape de la caractérisation des bases génétiques de la pathogénie de X. albilineans et d'une gestion plus durable de la résistance de la canne à sucre à l'échaudure des feuilles en Guadeloupe, et dans le monde.

Mots-clés Agrovoc : canne à sucre, Saccharum, Xanthomonas albilineans, pouvoir pathogène, toxine, ressource génétique, gène, agent pathogène, RFLP, PCR, échaudure, maladie des plantes, variation génétique