New molecular high throughput methods for Ehrlichia ruminantium tick screening and characterization of strain genetic structure in Mozambique and at worldwide scale

Cangi Nidia. 2017. New molecular high throughput methods for Ehrlichia ruminantium tick screening and characterization of strain genetic structure in Mozambique and at worldwide scale. Pointe-à-Pitre : Université des Antilles, 166 p. Thesis Ph.D. : Life science. Molecular biology and Genetic : Université des Antilles et de la Guyane

Titre français : Nouvelles méthodes moléculaires de criblage haut débit d'Ehrlichia ruminantium dans les tiques et caractérisation génétique des souches au Mozambique et à échelle mondiale

Encadrement : Gros, Olivier ; Neves, Luis ; Vachiéry, Nathalie

Résumé : Ehrlichia ruminantium is the causal agent of heartwater, a ruminant tropical fatal disease transmitted by Amblyomma ticks. Up to now, no effective vaccine is available due to a limited cross protection of vaccinal strains on field isolates mainly associated to a high genetic diversity of E. ruminantium within geographical locations. Thus, both characterization of E. ruminantium genetic population structure at worldwide and regional scale and estimation of E. ruminantium tick prevalence are important to delimitate better control strategies and improve heartwater monitoring strategies. In Section I, we developed two new qPCR s, pCS20 Sol1 T q M and Sol1 SG, to scree n E. ruminantium in Amblyomma ticks, which are powerful tools for: 1) heartwater epidemiological studies, 2) diagnosis in the context of heartwater clinical cases and 3) follow - up of experimental infections, both in ticks and hosts. The pCS20 Sol1 T q M qPCR was found as sensitive (up to 30 copies/ reaction ) and specific as the gold standard pCS20 nested PCR but less prone to sample contamination and less time - consuming. The whole method including the automated DNA extraction and pCS20 Sol1 T q M qPCR demonstrate d to be sensitive, specific and reproducible. It displayed the same limit of detection of the manual DNA extraction and pCS20 nested PCR, (60 copies/ reaction). Moreover, the development of a high - throughput automated DNA/RNA extraction makes the screen of any tick - borne pathogen in several tick species possible. The development of this new method allowed processing of a high number of tick samples collected in Mozambique that were then typed by Multi Locus Sequence Typing (MLST) and included into a worldwide E. ruminantium strain genetic structure study ( Section II ). Our study reveals the repeated occurrence of recombination between E. ruminantium genotypes and its important role in E. ruminantium genetic div ersity and evolution. Despite the unclear phylogeny and phylogeography due to recombination events, E. ruminantium isolates are clustered into two main groups: Group 1 (West Africa) and a Group 2 (worldwide) which is represented by West, East and South Afr ica, Indian Ocean and Caribbean strains. Common genotypes between West Africa and Caribbean and Southern Africa and Indian Ocean allow to identify two possible ways of E. ruminantium introduction in these regions, associated with cattle movement. In S ecti on III, we focused mainly on E. ruminantium tick prevalence and genetic diversity and structure of Mozambican isolates from A. variegatum and A. hebraeum ticks collected in cattle and wildlife. Sampling was performed in 30 localities for Mozambique and in Kruger National Park (KNP, South Africa). E. ruminantium tick prevalence in cattle was between 0% [0 - 23.2 %] and 26.7% [12 - 45 %], with no infected ticks in 7 localities. In wildlif e, tick prevalence was 8.2 [4 - 14.6 %] % in the KNP and 6.2% [0.2 - 30.2 %] in hunting concessions of Sofala province. However, no significant difference in prevalence was found between sampling sites and tick species, as well as no linear correlation between E. ruminantium prevalence and tick abundance was observed. There was a high genetic diversity of E. ruminantium, with 39 different genotypes detected and distribution of identical genotypes in several distant localities. Most genotypes from Mozambique clu stered in genetic subgroup G2C (strictly clustering Zimbabwe and Mozambican isolates) and G2E. Interestingly, genotypes from group G1 and G2D associated mainly with West Africa and Caribbean strains were in minority , probably highlighting a recent introduction.

Résumé (autre langue) : Ehrlichia ruminantium est l'agent causal de la cowdriose, une maladie tropicale mortelle des ruminants transmise par les tiques Amblyomma. Jusqu'à présent, il n'existe pas de vaccin efficace dû à la faible protection croisée des souches vaccinales vis-à-vis des isolats de terrain. Ceci est principalement lié à la diversité génétique d'E. ruminantium au sein des zones géographiques. Par conséquent, la caractérisation de la structure génétique de population d'E. ruminantium à l'échelle mondiale et régionale est importante pour définir les meilleures stratégies de contrôle et améliorer les stratégies de surveillance de la cowdriose. Au cours de la thèse, nous avons développé 2 PCRs quantitatives, pCS20 Sol1TM et Sol1SG, pour cribler E. ruminantium dans les tiques Amblyomma. Ce sont des outils puissants pour : 1) les études épidémiologiques sur la cowdriose 2) le diagnostic dans un contexte de confirmation de cas cliniques 3) le suivi des infections expérimentales à la fois sur tiques et sur hôte. La qPCR Sol1TM a été trouvée aussi sensible et aussi spécifique que la PCR nichée pCS20, le test de référence, mais moins sujette à la contamination des échantillons et plus rapide. La méthode complète incluant l'extraction automatique d'ADN et la qPCR pCS20 Sol1TM était sensible, spécifique et reproductible. De plus, le développement de l'extraction d'ADN/ARN haut débit permet le criblage des pathogènes transmis par les tiques dans différentes espèces de tiques. Le développement de cette nouvelle méthode a permis de traiter un grand nombre d'échantillons de tiques collectées au Mozambique. Ces échantillons ont ensuite été typés par typage multi locus de séquences (MLST, Multi Locus Sequence Typing) et inclus dans l'étude de structure génétique des souches d'E. ruminantium à l'échelle mondiale. Notre étude révèle l'apparition répétée de recombinaison entre les génotypes d'E. ruminantium et leur rôle important dans l'évolution et la diversité génétique d'E. ruminantium. Malgré une phylogénie et une phylogéographie peu claires dues aux phénomènes de recombinaison, les isolats d'E. ruminantium sont regroupés dans 2 grands groupes : Groupe 1 (Afrique de l'Ouest) et Groupe 2 (mondial) qui représente des souches d'Afrique de l'Ouest, de l'Est et du Sud, de l'Océan Indien et de la Caraïbe. Les génotypes communs entre Afrique de l'Ouest et Caraïbe et Sud de l'Afrique et Océan Indien permettent d'identifier 2 voies possibles d'introduction d'E. ruminantium dans ces régions associées au mouvement du bétail.Nous nous sommes focalisés principalement sur la prévalence d'E. ruminantium dans les tiques, la diversité génétique et la structure des isolats mozambicains venant des tiques A. variegatum et hebraeum collectées sur bovin et faune sauvage. L'échantillonnage a été effectué dans 30 localités du Mozambique et dans le Parc National Kruger (KNP, Afrique du Sud). La prévalence d'E. ruminantium chez les bovins était comprise entre 0% [0-23.2 %] et 26.7% [12-45 %], avec des tiques non infectées dans 7 localités. Sur la faune sauvage, la prévalence dans les tiques était de 8.2% [4-14.6 %] au KNP et 6.2% [0.2-30.2 %] dans les concessions de chasse de la province de Sofala. Cependant, il n'y a pas eu de différence significative entre sites échantillonnés et entre espèces de tiques, de même aucune corrélation linéaire n'a été trouvée entre la prévalence d'E. ruminantium et l'abondance des tiques. Il y avait une grande diversité génétique d'E. ruminantium, avec 39 génotypes différents détectés et une distribution de génotypes identiques dans plusieurs localités distantes. La plupart des génotypes du Mozambique sont regroupées dans des sous-groupes génétiques G2C (regroupant uniquement des isolats mozambicains et zimbabwéens) et G2E. Les génotypes du groupe G1 et G2D associés principalement aux souches d'Afrique de l'Ouest et de la Caraïbe étaient minoritaires mettant probablement en lumière une introduction récente.

Mots-clés Agrovoc : Ehrlichia, agent pathogène, maladie transmissible par tiques, méthodologie, diagnostic, test biologique, biologie moléculaire, Amblyomma, Amblyomma hebraeum, Amblyomma variegatum, distribution géographique, variation génétique, génétique des populations, épidémiologie, PCR, Ehrlichia ruminantium

Mots-clés géographiques Agrovoc : Mozambique, Afrique, Caraïbes, océan Indien

Mots-clés libres : Ehrlichia ruminantium, Pathogen, Heartwater, Mozambic

Classification Agris : L72 - Organismes nuisibles des animaux
L73 - Maladies des animaux
U30 - Méthodes de recherche

Champ stratégique Cirad : Axe 4 (2014-2018) - Santé des animaux et des plantes

Auteurs et affiliations

• Cangi Nidia, CIRAD-BIOS-UMR ASTRE (GLP)

Source : Cirad-Agritrop (https://agritrop.cirad.fr/583785/)

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