La biosynthèse non ribosomique chez les bactéries du genre Xanthomonas

Sabri Souhir. 2016. La biosynthèse non ribosomique chez les bactéries du genre Xanthomonas. Montpellier : Montpellier SupAgro, 167 p. Thèse de doctorat : Biologie des interactions : Montpellier SupAgro

Encadrement : Royer, Monique ; Cociancich, Stéphane

Résumé : La voie de biosynthèse non ribosomique, nommée NRPS pour "non-ribosomal peptide synthesis", permet aux bactéries et aux champignons de produire des peptides ou d'autres métabolites secondaires. Elle fait intervenir des mégaenzymes multimodulaires qui forment des "chaînes de montage", chaque module étant responsable de l'incorporation d'un monomère donné qui peut être un acide aminé protéinogénique ou non. La capacité de la voie NRPS à incorporer plus de 500 monomères différents contribue à la très grande diversité structurale des peptides non ribosomiques. Pour chaque module, la reconnaissance spécifique d'un monomère dépend de la séquence du domaine d'adénylation (A). Des outils bioinformatiques permettent, à partir de la séquence d'un domaine A, de prédire la nature du monomère incorporé par un module donné. Le genre bactérien Xanthomonas comprend 27 espèces associées aux plantes provoquant des maladies sur plantes mono- ou dicotylédones. Xanthomonas albilineans est l'agent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre. Son génome comprend plusieurs loci NRPS dont deux sont très originaux et font l'objet de ce travail. Le premier permet la biosynthèse de l'albicidine, un puissant antibiotique de 842 Da dont la structure a été publiée en 2015. L'originalité du locus albicidine réside dans sa capacité à incorporer deux monomères inhabituels : le para-aminobenzoate (p ABA) et la cyanoalanine. Le second code un peptide de 2293 Da appelé META-B dont la structure complète et la fonction restent inconnues. La particularité du locus META-B est la présence de cinq gènes permettant la biosynthèse d'un monomère inhabituel, la 3,5-dihydroxyphenylglycine (Dpg), et d'un gène appelé staM codant une monooxygénase dont la fonction est inconnue. Le premier objectif de ma thèse était de mieux caractériser la fonction des gènes de biosynthèse de l'albicidine. J'ai ainsi construit par ingénierie génétique des souches de X. albilineans dont un des gènes de biosynthèse de l'albicidine a été délété ou muté. J'ai également recherché dans les bases de données des gènes homologues aux gènes de biosynthèse de l'albicidine et ai mis en évidence des domaines conservés potentiellement impliqués dans l'activité de ces gènes. Cette approche a aussi permis d'identifier des loci NRPS codant des molécules encore inconnues mais dont la structure est potentiellement très originale car elle comprend du p ABA ou de la cyanoalanine. Le second chapitre de ma thèse porte sur l'étude des voies de biosynthèse du peptide META-B. L'analyse en spectrométrie de masse du peptide purifié montre qu'il comprend 17 acides aminés, dont celui en position N-terminale est lié à une chaîne carbonée de 228 Da. Seize de ces 17 acides aminés correspondent aux monomères prédits à partir de la séquence du locus META-B disponible sur GenBank et ne comprenant que 16 modules NRPS. De nouvelles données de séquençage m'ont permis de confirmer l'existence d'un module NRPS supplémentaire responsable de l'incorporation du 17ème monomère. J'ai aussi construit trois mutants différents pour étudier la fonction du gène staM du locus META-B. La troisième partie de ma thèse est consacrée à l'étude de la fonction du peptide META-B. La présence du locus META-B chez trois espèces de Xanthomonas phylogénétiquement distantes et associées à des plantes monocotylédones suggère que la nouvelle famille de petites molécules produite par ce locus pourrait jouer un rôle dans les interactions plante-bactérie. Pour explorer cette hypothèse, j'ai étudié la capacité de souches de X. albilineans affectées dans la production du peptide META - B à se multiplier chez la canne à sucre ou le maïs. J'ai également utilisé le peptide META-B isolé en HPLC pour étudier son activité sur des bactéries, champignons ou oomycètes ou pour rechercher une activité sidérophore. La fonction du peptide META-B reste inconnue mais l'élucidation complète de sa structure ouvrira de nouvelles perspectives décrites dans ce manuscrit.

Résumé (autre langue) : The non-ribosomal biosynthesis pathway, named NRPS for "non-ribosomal peptide synthesis", allows bacteria and fungi to produce peptides or other secondary metabolites. It involves multimodular megaenzymes which act as "assembly lines", each module being responsible of the incorporation of a given monomer which can be either a proteinogenic or a non-proteinogenic aminoacid. The ability of the NRPS pathway to incorporate over 500 different monomers contributes to the great structural diversity of the non-ribosomal peptides. For each module, the specific recognition of a monomer depends of the sequence of the adenylation (A) domain. Bioinformatic tools allow, according to the sequence of an A-domain, to predict the nature of the monomer incorporated by a given module. The bacterial genus Xanthomonas includes 27 plant-associated species provoking diseases on mono-or dicotyledonous plants. Xanthomonas albilineans is the causal agent of the sugarcane leaf scald disease. Its genome contains several NRPS loci among which two are very original and are the focus of this work. The first one allows the biosynthesis of albicidin, a 842-Da potent antibiotic, the structure of which has been published in 2015. The originality of the albicidin locus stands in its capacity to incorporate two unusual monomers: the para-aminobenzoic acid (p ABA) and the cyanoalanine. The second one encodes a 2293-Da peptide named META-B, the complete structure and function of which remaining unknown. The peculiarity of the META-B locus is the presence of five genes allowing the biosynthesis of an unusual monomer, the 3,5-dihydroxyphenylglycine (Dpg), and of a gene called staM encoding a monooxygenase, the function of which is unknown. The first objective of my thesis was to better characterize the function of the genes of biosynthesis of albicidin. Thus, I constructed by genetic engineering strains of X. albilineans in which one of the albicidin biosynthesis genes was either deleted or mutated. I also searched within databases for homologous genes of the albicidin biosynthesis genes, and highlighted conserved domain s potentially involved in the activity of these genes. This approach also allowed to identify NRPS loci encoding molecules yet unknown, but the structure of which is potentially very original since it includes p ABA and cyanoalanine. The second chapter of my thesis concerns with the study of the biosynthetic pathway of the META-B peptide. The analysis in mass spectrometry of the purified peptide shows that it contains 17 aminoacids, with the N-terminal one being linked to a 228-Da carbon chain. Sixteen out of these 17 aminoacids correspond to the monomers predicted according to the sequence of the META-B locus available in GenBank and which contains only 16 NRPS modules. New sequencing data allowed us to confirm the existence of an additional NRPS module which governs the incorporation of the 17th monomer. I also prepared three different mutants to study the function of the gene staM of the locus META-B. The third part of my thesis is dedicated to the study of the function of the META-B peptide. The occurrence of the META - B locus in three phylogenetically distant monocotyledonous-associated Xanthomonas species suggests that the new family of small molecules produced by this locus may play a role in plant-bacteria interactions. To explore this hypothesis, I studied the ability of strains of X. albilineans affected in the META-B peptide production to multiply in sugarcane or maize. I also used the HPLC-isolated META-B peptide to study its activity on bacteria, fungi or oomycetes, or to search for a siderophore activity. The function of the META-B peptide remains unknown, but the complete elucidation of its structure will open-up new perspectives described in this manuscript.

Mots-clés Agrovoc : biosynthèse, phytotoxine, Xanthomonas, Xanthomonas albilineans, métabolite secondaire, mutant, antibiotique, génie génétique, gène, peptide, acide aminé, enzyme, ligase, microbiologie, biologie moléculaire, PCR, Clonage moléculaire, HPLC, spectrométrie de masse, Saccharum officinarum, Zea mays, relation hôte pathogène, interactions biologiques

Mots-clés complémentaires : Albicidine

Classification Agris : H20 - Maladies des plantes
000 - Autres thèmes
U30 - Méthodes de recherche

Champ stratégique Cirad : Axe 1 (2014-2018) - Agriculture écologiquement intensive

Auteurs et affiliations

• Sabri Souhir, CIRAD-BIOS-UMR BGPI (FRA)

Source : Cirad-Agritrop (https://agritrop.cirad.fr/582320/)

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